MANIPULASI GENETIK SACCHAROMYCES CEREVISIAE DALAM

 

Re-edited  20 December, 2000

Copyright © 2000 Ni Nyoman Tri Puspaningsih  

Makalah  Falsafah Sains (PPs 702)

Program Pasca Sarjana - S3

Institut Pertanian Bogor

 

Dosen:  Prof Dr Ir Rudy C Tarumingkeng

 

 

 

MANIPULASI GENETIK SACCHAROMYCES CEREVISIAE DALAM UPAYA

MENINGKATKAN PRODUKSI ETANOL

 

 

Oleh :

 

Ni Nyoman Tri Puspaningsih

P17600004/BIO

 

nyomantri@hotmail.com

 

 

I.  Latar belakang  (Pendekatan Ontologi dan Epistemologi)

                                                                                                                                                           

Saccharomyces cerevisiae merupakan mikroorganisme yang sangat dikenal oleh masyarakat luas sebagai ragi roti (baker’s yeast). Ragi roti ini digunakan dalam pembuatan makanan, minuman dan juga dalam industri etanol (Russel et al., 1991). Etanol merupakan salah satu produk industri yang penting di Indonesia, baik sebagai alternatif bahan bakar yang ramah lingkungan maupun fungsinya yang lain sebagai bahan baku industri kimia, sebagai pelarut dan sebagai desinfektan dalam bidang kesehatan. Etanol dapat diproduksi dari bahan baku glukosa, tetes tebu dan pati. Namun demikian,  dewasa ini bahan-bahan baku tersebut cukup sulit diperoleh. Oleh karena itu, perlu dikembangkan penelitian-penelitian dasar yang nantinya mampu diterapkan dalam industri etanol. Penelitian-penelitian yang dapat dikembangkan antara

lain mencari bahan baku alternatif yang tersedia dalam jumlah berlimpah, optimalisasi proses fermentasi atau memanipulasi mikroorganisme yang berperan dalam proses fermentasi etanol.

Penelitian manipulasi genetik terhadap mikroorganisme yang berperan dalam fermentasi etanol merupakan topik penelitian yang penting untuk dilakukan. Hal ini disebabkan segala aspek penelitian yang dilakukan dalam fermentasi etanol sangatlah bergantung pada keunggulan dari mikroorganisme yang digunakan, dan dalam industri etanol mikroorganisme Saccharomyces cerevisiae sering digunakan, termasuk industri etanol di Indonesia. Oleh karena itu manipulasi genetik

Saccharomyces cerevisiae untuk meningkatkan produksi etanol perlu dilakukan,

sehingga ketersediaan dan efisiensi produksi etanol dapat terpenuhi.

 

Ragi Saccharomyces cerevisiae mempunyai sekitar 14.000 kb DNA kromosom  (85& dari DNA total) yang terdistribusi ke dalam 16 kromosom yang berbeda dan telah dikarakterisasi secara genetik. Selain itu Saccharomyces  cerevisiae  mempunyai dua unsur genetik yang lain, yaitu DNA mitokondria dan DNA plasmid 2m. Beberapa galur mengandung unsur ketiga yang disebut plasmid pembunuh (killer plasmid) (Watson et al., 1987).

 

Setiap sel haploid ragi mempunyai sekitar 10 - 15 mitokondria yang terdistribusi sepanjang sitoplasma (± 10% dari massa sel). Mitokondria ini mempunyai unsur genetik tersendiri (DNA mitokondria) (Watson et al., 1987). DNA mitokondria Saccharomyces cerevisiae berbentuk sirkuler dan peta restriksinya telah diketahui. Ukuran DNA mitokondria ini sekitar 75-80 kb bergantung pada jenis galurnya. DNA mitokondria ini berada dalam 40-50 kopi per sel dan sekitar 10% dari DNA total sel ragi (Guthrie et al., 1991).  Perbedaan antara DNA kromosom dengan DNA mitokondria di antaranya adalah dalam DNA mitokondria tidak ditemukan aktivitas proofreading, sehingga menyebabkan laju mutasi di mitokondria lebih tinggi dibandingkan dalam gen kromosom. Protein yang dikode oleh DNA  mitokondria disintesis dalam bagian mitokondria yang disebut mitoribosom. Perbedaan lain dalam sistem genetik mitokondria adalah bahwa kodon UGA tidak dibaca sebagai kodon terminasi melainkan dikode untuk asam amino triptofan (Watson et al., 1987).

                                                                                                                                                            Mitokondria merupakan organela yang berperan penting dalam metabolisme respirasi untuk menghasilkan ATP. Kerusakan pada fungsi DNA mitokondria menyebabkan mutan tidak dapat melakukan respirasi dan akibatnya tidak lagi dipengaruhi oleh Efek Pasteur, misalnya supresi oksigen selama glikolisis (Hutter, A. et al., 1998). Peristiwa ini diduga menyebabkan laju fermentasi etanol menjadi lebih tinggi. Mutasi pada DNA mitokondria akan menghasilkan mutan yang disebut mutan petite. Hutter et al. (1998) telah melaporkan bahwa mutan petite mampu meningkatkan kadar etanol 30 - 40% dibanding tipe liarnya. Dalam penelitian tersebut digunakan Saccharomyces cerevisiae galur ATCC. Valadi, H. et al. (1998) telah pula melaporkan upaya peningkatan produksi etanol menggunakan mutan Saccharomyces cerevisiae pada lokus gen pengkode enzim gliserol-3-fosfat dehodrogenase. Mac. Iver, F.H. et al. (1997) telah mengidentifikasi DNA mitokondria Saccharomyces cerevisiae yang berperansebagai promotor dalam mengendalikan sumber karbon.

                                                                                                                                                            Manipulasi genetik DNA kromosom Saccharomyces cerevisiae telah dilakukan oleh Puspaningsih, N.N.T. (1994) dengan cara mutasi secara kimiawi guna mempelajari keterlibatan gen SAL4 dalam proses ketepatan translasi dan/atau faktor terminasi. Mutasi pada penelitian tersebut menggunakan mutagen kimia dan cara ini mempunyai kelemahan, yaitu mutagen kimia bersifat karsinogenik sehingga dapat membahayakan peneliti. Oleh karena  itu , dalam penelitian ini akan dilakukan mutasi secara fisika sinar UV) dalam suatu kotak bertutup sehingga tidak membahayakan peneliti.

 

II. Perumusan Masalah

 

 1. Bagaimanakan perubahan genetik mutan petite Saccharomyces  cerevisiae  dibandingkan dengan tipe liarnya ?

    2. Berapa prosenkah mutan petite mampu meningkatkan produksi etanol?

 

III. Hipotesis dan Tujuan Khusus

 

      Hipotesis :

Mutan petite yang dihasilkan dari mutasi DNA mitokondria  Saccharomyces cerevisiae tidak mampu meningkatkan produksi etanol

 

     Tujuan Khusus :

     1. memperoleh mutan petite Saccharomyces cerevisiae yang mampu   meningkatkan  kadar etanol

     2. menentukan perbedaan genetik (analisis restriksi) mutan petite dengan tipe liarnya

 

IV. Manfaat Penelitian (Pendekatan Aksiologi)

                                                                                                                                                            Mutan petite Saccharomyces cerevisiae yang dihasilkan akan mampu meningkatkan kadar etanol, sehingga walaupun ketersediaan bahan baku terbatas, mutan ini mampu menghasilkan etanol lebih tinggi dibanding tipe liarnya. Hal ini tentunya akan menguntungkan bagi industri etanol dan diharapkan kebutuhan etanol dalam negeri dapat terpenuhi.

 

V. Metodologi

 

  1. Isolasi dan karakterisasi mutan petite Saccharomyces cerevisiae
  2. 1. Mutasi DNA mitokondria Saccharomyces cerevisiae dengan cara radiasi sinar

ultraviolet pada panjang gelombang 254 nm dalam kotak bertutup.

2. Isolasi mutan petite menggunakan media selektif YPD (yeast peptone  dextrose) dan YPG(yeast peptone glicerol). Mutan petite mampu tumbuh dalam medium YPD sebaliknya tidak tumbuh dalam medium YPG.

 

3. Isolasi DNA mitokondria murni dari mutan petite dilakukan dengan metode

gradien densitas dengan penambahan 4’,6-diamidino-2-phenylimdole yang akan terikat pada DNA mitokondria yang kaya akan A+T, sehingga dapat dipisahkan dari DNA kromosomnya. Tahap ini juga dilakukan terhadap DNA mitokondria tipe liar untuk dibandingkan analisis genetiknya.

 

4. Karakterisasi terhadap DNA mitokondria murni dari tipe liar dan mutannya

dilakukan dengan analisis restriksi menggunakan beberapa enzim restriksi.

Hasil pemotongan oleh enzim restriksi tersebut antara tipe liar dan mutan akan dibandingkan.

 

C. Penggunaan mutan petite Saccharomyces cerevisiae untuk produksi etanol

 

1. Fermentasi etanol oleh mutan petite dilakukan menggunakan metode

Krishnan, M.S. et al. (1995).  Sebagai perbandingan dilakukan pula fermentasi

etanol oleh Saccharomyces cerevisiae tipe liarnya.

 

2. Pemurnian etanol dengan destilasi fraksi

 

3. Penentuan kadar etanol dengan Kromatografi Gas

 

VI. Daftar Pustaka

 

Ausubel, F.M., 1992, Short Protocols in Molecular Biology, 2nd. Ed.,   Greene Publishing Associates & John Wiley & Sons, New York.

 

Guthrie, C. and Fink, R.G., 1991, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic Press, New York.

 

Hutter, A. and Oliver, S. G., 1998, Ethanol Production using Nuclear Petite Yeast Mutants, Appl. Microbiol.Biotechnol., 49(5)

 

Krishnan, M.S. ; Xia, Y.;  Tsao, T .G.; Kasthurikrishnan, N.; Srinivasan, N. and Cooks, R.G., 1995, Process Engineering of High Ethanol-Tolerance Yeast for

The Manufacture of Ethanol, Applied Biochemistry and Biotechnology, 51(52).

 

MacIver, F.H.;  Dawes, I. A. and Grant, C. M., 1997, Identification of a

Saccharomyces cerevisiae Mithocondrial-DNA which can act as a Promotor

Tightly Regulated by Carbon Source when Placed in the Nucleus, Curr.Genet.,

31

 

Puspaningsih, N.N.T., 1994, Isolasi dan Karakterisasi mutan sal4 di Ragi

(Saccharomyces cerevisiae), Tesis S2, ITB, Bandung

 

Russel,C; Mawson, J and Pak Lam Yu, 1991, A Review of Production of

Recombinant Products in Yeasts, Australian Journal of Biotechnology, 5.

 

Valadi,H; Larson,C and Gustafson,L., 1998, Improved Ethanol production by

Glycerol-3-phosphate dehydrogenase Mutants of Saccharomyces cerevisiae,

Appl.Microbiol Biotechnol., 50(4).

 

Watson; Hopkins; Roberts; Steitz and Weiner, 1987, Molecular Biology of The

Gene, 5th. Ed., The benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., California.